2.1.Ytelsesegenskaper som skal bestemmes for analysemetoder►M2 Tabell 5
Klassifisering av analysemetoder etter ytelsesegenskapene som skal bestemmes| Metode | Bekreftelse | Screening |
|---|
| Kvalitativ | Kvantitativ | Kvalitativ | Semi-kvantitativ (+) | Kvantitativ |
|---|
| Stoffer | A | A, B | A, B | A, B | A, B |
| Identifikasjon i samsvar med 1.2 | x | x | | | |
| CCα | x | x | | | |
| CCβ | - | | x | x | x |
| Riktighet | x | | | x |
| Presisjon | x | | (x) | x |
| Relativ matrisevirkning/absolutt gjenfinning(*) | x | | | x |
| Selektivitet/spesifisitet | x | x | x | x |
| Stabilitet(#) | x | x | x | x |
| Robusthet | x | x | x | x |
x: Gjennom valideringen skal det bevises at kravene til ytelsesegenskapene er oppfylt.
(x): Presisjonskravene i kapittel 1.2.2.2 behøver ikke oppfylles for semikvantitative screeningmetoder. Presisjonen skal imidlertid bestemmes for å vise at metoden er egnet for å unngå falske negative analyseresultater.
A: forbudte eller ikke-tillatte stoffer
B: tillatte stoffer
(+):En semikvantitativ screeningmetode er en screeningmetode som gir kvantitative resultater, men som ikke oppfyller presisjonskravene i tabell 2 i vedlegg I til denne forordningen.
(*): Det er relevant for MS-metoder at valideringen viser at kravene til prestasjonsegenskapene er oppfylt. Metodens relative matrisevirkning skal bestemmes dersom denne virkningen ikke ble vurdert under valideringen. Den absolutte gjenfinningen ved metoden skal bestemmes når det ikke brukes noen intern standard eller en matrisetilsatt kalibrering.
(#): Dersom det foreligger stabilitetsdata for analytter i en matrise i vitenskapelig litteratur eller fra et annet laboratorium, er det ikke nødvendig at det berørte laboratoriet fastsetter dem igjen. En henvisning til tilgjengelige stabilitetsdata for analytter i løsninger er imidlertid bare akseptabel dersom betingelsene er identiske. ◄M2
|
2.2.Riktighet, repeterbarhet og intern reproduserbarhet►M22.2.1.Konvensjonell validering2.2.1.1.2.2.1.2.2.2.1.3.2.2.1.4.2.2.2.Validering etter alternative modeller►M22.2.3.Andre valideringsmåter2.3.Selektivitet/spesifisitet2.4.Robusthet2.5.Stabilitet►M22.5.1.Bestemmelse av analyttens stabilitet i løsning
Ci = konsentrasjon på gitt tidspunkt i
Cny = konsentrasjon for nylaget løsning
►M22.5.2.Analytten(e)s stabilitet i matrise
2.6.Beslutningsgrense for bekreftelse (CCα)2.7.Påvisningsevne ved screening (CCβ)2.8.Kalibreringskurver2.9.Absolutt gjenfinning►M22.10.Relative matrisevirkninger►M2 Valideringen av metoden skal vise at analysemetoden oppfyller kriteriene for de relevante ytelsesegenskapene. Ulike kontrollformål krever ulike metodekategorier. I tabell 5 er det fastsatt hvilke ytelsesegenskaper som skal kontrolleres for de aktuelle metodene, og hver parameter forklares nærmere i dette kapittelet.
Denne delen inneholder eksempler på og referanser til framgangsmåter for validering. Andre framgangsmåter for å påvise at metoden oppfyller ytelseskriteriene kan brukes, forutsatt at opplysningene de gir har tilsvarende nivå og kvalitet.
Beregning av parametrene etter konvensjonelle metoder krever at det utføres flere enkeltforsøk (se tabell 5 i dette vedlegget). For store endringer må det verifiseres at ytelsesegenskapene fortsatt er gyldige. For metoder der det brukes flere analytter, kan flere analytter analyseres samtidig dersom eventuelle relevante interferenser er blitt utelukket. Mange ytelsesegenskaper kan bestemmes på en lignende måte. For å minske arbeidsmengden bør derfor forsøk i størst mulig grad kombineres (f.eks. repeterbarhet og intern reproduserbarhet med spesifisitet, analyse av blindprøver for å bestemme beslutningsgrensen for bekreftelse, og prøving for spesifisitet). ◄M2
Riktighet på grunnlag av et sertifisert referansemateriale
Det er ønskelig å bestemme en analysemetodes riktighet ved hjelp av sertifisert referansemateriale. Framgangsmåten for dette er beskrevet i ISO 5725-4:1994.
Et eksempel:- Analyser seks parallellprøver av det sertifiserte referansematerialet i samsvar med prøvingsinstruksjonene for metoden.
- Bestem konsentrasjonen av analytten som forekommer i hver parallellprøve.
- Beregn gjennomsnittet, standardavviket og variasjonskoeffisienten (%) for disse seks konsentrasjonene.
- Beregn riktigheten ved å dividere den påviste gjennomsnittskonsentrasjonen med den sertifiserte verdien (målt som konsentrasjon) og multipliser med 100 for å uttrykke resultatet i prosent.
$$\text{Riktighet (\%)} = \text{påvist gjennomsnittlig konsentrasjon korrigert for gjenfinning } \cdot 100 / \text{sertifisert verdi}$$
Riktighet på grunnlag av prøver med tilsetning
Dersom det ikke finnes noe sertifisert referansemateriale, skal metodens riktighet bestemmes ved forsøk med en blindmatrise med tilsetning, som et minimum etter følgende framgangsmåte:- For metoder som er validert fra datoen for denne forordningens ikrafttredelse, velg blindmateriale og tilsett en konsentrasjon på►M2
- 0,5, 1,0 og 1,5 ganger referanseverdien for tiltak, eller ◄M2
- 0,1, 1,0 og 1,5 ganger øvre grenseverdi for restmengder eller høyeste tillatte innhold for godkjente stoffer, eller
- 1,0, 2,0 og 3,0 ganger laveste kalibrerte nivå for ikke-godkjente stoffer (som det ikke er fastsatt referanseverdi for tiltak for).
- På hvert nivå skal analysen utføres med seks parallellprøver.
- Analyser prøvene.
- Beregn konsentrasjonen som påvises i hver prøve.
- Beregn riktigheten for hver prøve ved hjelp av ligningen nedenfor, og beregn deretter gjennomsnittlig riktighet og variasjonskoeffisient for de seks resultatene på hvert konsentrasjonsnivå.
$$\text{Riktighet (\%)} = \text{påvist gjennomsnittlig konsentrasjon korrigert for gjenfinning } \cdot 100 / \text{tilsetningsnivå}$$
For metoder for godkjente stoffer som er validert før anvendelsesdatoen for denne forordningen, er det tilstrekkelig å bestemme metodens riktighet ved bruk av 6 delmengder med tilsetning ved 0,5, 1,0 og 1,5 ganger grenseverdien for restmengder eller høyeste tillatte innhold.
Repeterbarhet- For metoder som er validert fra datoen for denne forordningens ikrafttredelse, skal det tilberedes et sett prøver med identiske blindmatriser av samme art. De skal tilsettes analytten til konsentrasjoner som tilsvarer
►M2- 0,5, 1,0 og 1,5 ganger referanseverdien for tiltak, eller ◄M2
- 0,1, 1,0 og 1,5 ganger grenseverdien for restmengder eller høyeste tillatte innhold for godkjente stoffer, eller
- 1,0, 2,0 og 3,0 ganger laveste kalibrerte nivå for ikke-godkjente eller forbudte stoffer dersom det ikke er fastsatt noen referanseverdi for tiltak.
- På hvert nivå skal analysen utføres med minst seks parallellprøver.
- Analyser prøvene.
- Beregn konsentrasjonen som påvises i hver prøve.
- Beregn gjennomsnittskonsentrasjonen, standardavviket og variasjonskoeffisienten (%) for prøvene med tilsetning.
►M2 - Gjenta disse trinnene ved minst to andre anledninger for til sammen minst 18 parallellprøver per nivå. ◄M2
- Beregn samlet middelkonsentrasjon, standardavvik (ved å beregne standardavviket i annen potens for de enkelte tilfellene og ta kvadratroten av dette) og variasjonskoeffisientene for prøvene med tilsetning.
For metoder for godkjente stoffer som er validert før datoen for ikrafttredelse av denne forordningen, er det tilstrekkelig å bestemme repeterbarheten ved bruk av matriser med tilsetning ved konsentrasjoner på 0,5, 1,0 og 1,5 ganger grenseverdien for restmengder eller høyeste tillatte innhold.
Alternativt kan beregningen av repeterbarhet utføres i henhold til ISO 5725-2:2019.
Intern reproduserbarhet- Ved validering som er utført etter datoen for ikrafttredelse av denne forordningen, tilberedes et sett med prøver av spesifisert prøvemateriale (identiske eller forskjellige matriser), med tilsetning av analytten(e) til konsentrasjoner som tilsvarer
►M2- 0,5, 1,0 og 1,5 ganger referanseverdien for tiltak, eller◄M2
- 0,1, 1,0 og 1,5 ganger grenseverdien for restmengder eller høyeste tillatte innhold for godkjente stoffer, eller
- 1,0, 2,0 og 3,0 ganger laveste kalibrerte nivå for ikke-godkjente eller forbudte stoffer dersom det ikke er fastsatt noen referanseverdi for tiltak.
- Utfør analysen ved hvert konsentrasjonsnivå med minst seks parallellprøver av blindmateriale.
- Analyser prøvene.
- Beregn konsentrasjonen som påvises i hver prøve.
►M2 - Gjenta disse trinnene ved minst to andre anledninger (for til sammen minst 18 parallellprøver per nivå) med ulike partier av blindmateriale, ulike operatører og så mange forskjellige miljøforhold som mulig, f.eks. ulike reagenspartier, ulike løsemidler, ulike romtemperaturer, ulike instrumenter eller en variasjon av andre parametrer. ◄M2
- Bestem gjennomsnittskonsentrasjonen, standardavviket og variasjonskoeffisienten (%) for prøvene med tilsetning.
For metoder for godkjente stoffer som er validert før datoen for ikrafttredelse av denne forordningen, er det tilstrekkelig å bestemme intern reproduserbarhet ved bruk av matriser med tilsetting ved konsentrasjoner på 0,5, 1,0 og 1,5 ganger grenseverdien for restmengder eller høyeste tillatte innhold.
Alternativt kan beregningen av intern reproduserbarhet/intermediær presisjon utføres i samsvar med ISO 5725-2:2019, ISO 11843-1:1997 og Codex CAC/GL 59-2006.
Beregning av parametrene etter alternative modeller krever at det gjennomføres en forsøksplan. Forsøksplanen skal utformes ut fra hvor mange ulike arter og faktorer som skal undersøkes. Første trinn i framgangsmåten for validering vil derfor være en vurdering av prøvepopulasjonene som skal analyseres i laboratoriet i framtiden, for å kunne bestemme de viktigste artene og hvilke faktorer som kan påvirke måleresultatene. Den faktorbaserte tilnærmingen gjør det mulig å vurdere måleusikkerheten for testresultatene, som er oppnådd under forskjellige prøvebetingelser i et gitt laboratorium, f.eks. forskjellige laboranter, forskjellige instrumenter, forskjellige partier av reagenser, forskjellige matriser, forskjellige analysetider og -temperaturer. Deretter skal konsentrasjonsområdet velges på en måte som er tilpasset formålet i samsvar med øvre grenseverdi for restmengder eller høyeste tillatte innhold for godkjente stoffer, eller referanseverdien for tiltak (RPA) eller laveste kalibrerte nivå (LCL) for forbudte eller ikke-godkjente stoffer.
Den faktorbaserte tilnærmingen har som mål å fastsette pålitelige presisjonsdata og måledata gjennom samtidig kontrollert variasjon av de utvalgte faktorene. Den gjør det mulig å evaluere den kombinerte virkningen av faktorvirkninger og tilfeldige virkninger. Utformingen av forsøket gjør det mulig å undersøke forsøksmetodens robusthet og bestemme standardavviket for intern reproduserbarhet i ulike matriser.
Nedenfor gis et eksempel på en alternativ framgangsmåte med anvendelse av en ortogonal plan for utformingen av forsøket.
Inntil sju faktorer (støyfaktorer) kan undersøkes. Undersøkelsen er utformet slik at presisjon, riktighet (basert på prøver med tilsetning), følsomhet, måleusikkerhet og kritiske konsentrasjoner kan bestemmes samtidig ved gjennomføring av forsøksplanen.Tabell 6
Eksempel på en ortogonal forsøksplan der sju faktorer (I–VII) varierer på to nivåer (A/B) i en valideringsundersøkelse med åtte kjøringer (kombinasjon av faktornivåer)| Faktor | I | II | III | IV | V | VI | VII |
|---|
| Kjøring 01 | A | A | A | A | A | A | A |
| Kjøring 02 | A | A | B | A | B | B | B |
| Kjøring 03 | A | B | A | B | A | B | B |
| Kjøring 04 | A | B | B | B | B | A | A |
| Kjøring 05 | B | A | A | B | B | A | B |
| Kjøring 06 | B | A | B | B | A | B | A |
| Kjøring 07 | B | B | A | A | B | B | A |
| Kjøring 08 | B | B | B | A | A | A | B |
Metodens egenskaper skal beregnes som beskrevet av Jülicher et al. eller ISO/TS 23471:2022 ◄M2
Andre framgangsmåter for å påvise at metoden oppfyller ytelseskriteriene for ytelsesegenskapene kan brukes, forutsatt at opplysningene de gir har tilsvarende nivå og kvalitet. Validering kan også utføres ved å gjennomføre en laboratoriesammenligning, for eksempel som definert i Codex Alimentarius, ISO eller IUPAC, eller i samsvar med alternative metoder, for eksempel undersøkelse foretatt ved ett laboratorium eller intern validering. Dersom alternative framgangsmåter for validering anvendes, skal den underliggende modellen og strategien og de respektive forutsetningene, antagelsene og formlene angis i valideringsprotokollen, eller det skal i det minste gis henvisninger til hvor de er tilgjengelige.
Evnen til å skille mellom analytten og nært beslektede stoffer skal bestemmes i størst mulig grad. Interferens fra homologer, isomerer, nedbrytingsprodukter, endogene stoffer, analoge stoffer og stoffskifteprodukter av den aktuelle restmengden, av matriseforbindelser eller andre potensielt forstyrrende stoffer skal bestemmes, og metoden skal om nødvendig endres for å unngå de identifiserte interferensene. For å bestemme metodens spesifisitet skal følgende framgangsmåte benyttes:- Velg et antall kjemisk beslektede forbindelser eller andre stoffer som kan forekomme sammen med den aktuelle forbindelsen, og som kan forekomme i prøvene, og kontroller om de kan forstyrre analysen av målanalytten(e).
- Analyser et passende antall representative blindprøver, for eksempel forskjellige partier eller partier fra forskjellige dyrearter (n ≥ 20) og kontroller om det foreligger interferens (signaler, topper, ionspor) i det aktuelle området hvor målanalytten forventes å eluere.
- Representative blindprøver tilsettes en relevant konsentrasjon av stoffer som potensielt kan påvirke identifikasjonen og/eller mengdebestemmelsen av analytten, og undersøk om det tilsatte stoffet
- kan føre til falsk identifikasjon,
- hindrer identifikasjon av målanalytten,
- påvirker mengdebestemmelsen merkbart.
Analysemetoden skal testes for å sikre at den fortsatt fungerer under forskjellige forsøksvilkår, som for eksempel omfatter andre prøvetakingsforhold og mindre endringer som kan oppstå ved rutinetesting. For prøving av metodens robusthet, bør endringene som innføres under forsøksvilkårene være små. Betydningen av disse endringene skal vurderes. Hver ytelsesegenskap skal bestemmes for alle store endringer som har vist seg å innvirke betydelig på forsøkets ytelse.
Stabiliteten til kalibreringsstandarden, den matrisetilpassede eller matrisetilsatte standarden og til analytten eller matrisebestanddelene i prøven under lagring eller analyse skal bestemmes, ettersom ustabilitet kan påvirke analyseresultatene.
Vanligvis er analyttens stabilitet godt beskrevet under forskjellige lagringsvilkår. Forsøkene som utføres for å overvåke lagringsvilkårene for standarder og prøver, som utføres som en del av det normale laboratoriets akkreditering og systemet for kvalitetskontroll, kan gi de nødvendige opplysningene. Dersom det finnes stabilitetsdata for analytter i matrisen (f.eks. på grunnlag av opplysninger fra EU-referanselaboratoriene, offentliggjorte data osv.), er det ikke nødvendig for hvert laboratorium å bestemme disse dataene. En henvisning til tilgjengelige stabilitetsdata for analytter i løsninger og i matrise er imidlertid bare akseptabel dersom betingelsene er identiske.
Dersom de påkrevde holdbarhetsdataene ikke er tilgjengelige, bør de følgende metodene brukes. En isokron tilnærming med en lagringstemperaturplan tilsvarende den i tabell 7 i dette vedlegget gjør det også mulig å bestemme analyttens potensielle ustabiliteter og å estimere passende lagringsperioder, og kan også brukes.
Tilbered nye stamløsninger av analytten(e) og fortynn dem i samsvar med prøvingsinstruksjonene for å få et tilstrekkelig antall delmengder (f.eks. 40) av hver valgte konsentrasjon. Prøvene skal tilberedes av- løsninger av analytten som brukes til tilsetting,
- analyttløsninger som brukes i den endelige analysen,
- enhver annen løsning som er av interesse (f.eks. derivatiserte standarder).
Mål analyttinnholdet i den nylig tilberedte løsningen i samsvar med prøvingsinstruksjonene.
Fordel passende mengder i egnede beholdere, som merkes og lagres i samsvar med lys- og temperaturforholdene i planen i tabell 7. Lagringstiden velges under hensyn til hvilken analysepraksis som følges, ideelt sett til de første nedbrytingstegnene kan observeres under identifikasjon og/eller mengdebestemmelse. Dersom det ikke observeres noen nedbryting under stabilitetsstudien, skal lagringstiden for stabilitetsstudien være lik den maksimale lagringstiden for løsningen.
Beregn konsentrasjonen av analytt(er) i hver delmengde sammenlignet med konsentrasjonen av analytten i den nylig tilberedte løsningen, i samsvar med følgende formel: $$\text{Resterende analytt }(\%)=C_{i}\cdot 100 / C_{ny}$$
Gjennomsnittsverdien for de fem replikatløsningene som ble lagret, skal ikke avvike mer enn 15 % fra gjennomsnittsverdien for de fem nylig tilberedte replikatløsningene. Gjennomsnittsverdien av de fem nylig tilberedte løsningene skal brukes som grunnlag for å beregne den prosentvise forskjellen.Tabell 7
Plan for bestemmelse av analyttens stabilitet i løsning | –20 °C | +4 °C | +20 °C |
|---|
| Mørkt | 10 delmengder | 10 delmengder | 10 delmengder |
| Lyst | | | 10 delmengder |
Bruk naturlig forurensede prøver om mulig. Dersom det ikke finnes noen naturlig forurenset matrise, skal en matrise tilsatt analytten brukes. Dersom det finnes en aktuell naturlig forurenset matrise, skal den homogeniseres, fortrinnsvis mens matrisen fortsatt er fersk. Del matrisen i fem porsjoner, og analyser én delmengde fra hver porsjon. Dersom det ikke finnes noen naturlig forurenset matrise, brukes en liten mengde blindmatrise, som homogeniseres. Del matrisen inn i fem porsjoner. Til hver porsjon tilsettes analytt nær det aktuelle nivået, som fortrinnsvis bør være tilberedt i en liten mengde vandig løsning. Analyser én delmengde fra hver porsjon umiddelbart. Lagre porsjonene (delprøvene) av den homogeniserte naturlig forurensede matrisen eller den tilsatte blindmatrisen ved en temperatur som gjenspeiler lagringsvilkårene vedtatt av laboratoriet for en gitt kombinasjon av analytt og matrise, og bestem konsentrasjonene av analytten etter kortvarig, mellomlang og langvarig lagring (minst så lenge prøven vanligvis oppbevares i laboratoriet). Gjennomsnittsverdien av de fem delmengdene av en porsjonsenhet som ble lagret, skal ikke avvike med mer enn metodens interne reproduserbarhet fra gjennomsnittsverdien av de fem nylig tilberedte delmengdene. Gjennomsnittsverdien av de fem nylig tilberedte delmengdene skal brukes som grunnlag for å beregne den prosentvise forskjellen. Registrer lengste akseptable lagringstid og optimale lagringsvilkår. ◄M2
CCα skal bestemmes for bekreftelsesmetoder. CCα skal fastsettes under forhold som samsvarer med kravene til identifikasjon eller identifikasjon og mengdebestemmelse som beskrevet under «Ytelseskriterier og andre krav til analysemetoder» som fastsatt i kapittel 1.
Ved kontroll av prøvenes samsvar er det allerede tatt hensyn til kombinert standard måleusikkerhet i CCα-verdien (beslutningsgrense for bekreftelse).- For ikke-tillatte eller forbudte farmakologisk aktive stoffer skal CCα beregnes på følgende måte:
- Metode 1: ved framgangsmåten med kalibreringskurve i samsvar med ISO 111843-1:1997 (hvor den kalles «kritisk verdi av nettotilstandsvariabelen»). I så fall skal det brukes blindmateriale med tilsetning til og over referanseverdien for tiltak (RPA) eller laveste kalibrerte nivå (LCL) i like store trinn. Analyser prøvene. Etter identifikasjon skal signalet, dersom dette er mulig, eller den nye beregnede konsentrasjonen plottes i forhold til den tilsatte konsentrasjonen. Beslutningsgrensen er lik den tilsvarende konsentrasjonen ved skjæringspunktet på y-aksen pluss 2,33 ganger standardavviket for den interne reproduserbarheten ved skjæringspunktet. Dette gjelder bare for kvantitative bestemmelser. Beslutningsgrenser som beregnes med denne metoden, skal kontrolleres ved å analysere blindmatrise med tilsetning til den beregnede beslutningsgrensen.
- Metode 2: ved analyse av minst 20 representative blindmaterialer per matrise for å beregne signal/støy-forholdet i det tidsintervallet der analytten forventes. Tre ganger signal/støy-forholdet kan brukes som beslutningsgrense. Dette gjelder for kvantitative og kvalitative bestemmelser. Beslutningsgrenser som beregnes med denne metoden, skal kontrolleres ved å analysere blindmatrise med tilsetning til den beregnede beslutningsgrensen.
- Metode 3: \(\begin{align}CC\alpha = \text{laveste kalibrerte nivå (LCL)} + k(\text{ensidig}, 99 \%) \cdot \\\text{(kombinert) standard måleusikkerhet ved laveste kalibrerte nivå}\end{align}\)For farmakologisk virksomme stoffer som ikke er godkjente eller som er forbudt, kan det avhengig av valideringsforsøket (og dets respektive frihetsgrader) være rimelig å anvende t-fordelingen, eller en k-faktor på 2,33 dersom normalfordeling (gaussisk fordeling) (ensidig, n=∞) legges til grunn.Den interne reproduserbarheten og riktigheten er egnet til å definere (kombinert) standard måleusikkerhet, dersom den bestemmes under hensyn til alle relevante faktorer som påvirker målingen.
Metode 2 for beregning av CCα kan bare brukes til og med 1. januar 2026 for metoder som er validert før datoen for denne forordningens ikrafttredelse. For metoder som er validert etter denne forordningens ikrafttredelse, skal bare metode 1 eller 3 brukes. - For godkjente stoffer skal CCα beregnes på følgende måte:
- For godkjente stoffer i matrise-/artskombinasjoner som det er fastsatt en grenseverdi for restmengder eller et høyeste tillatte innhold for:
- Metode 1: ved framgangsmåten med kalibreringskurve i samsvar med ISO 111843-1:1997 (hvor den kalles «kritisk verdi av nettotilstandsvariabelen»). I så fall skal det brukes blindmateriale med tilsetning til og over grenseverdien for restmengder (MRL) eller høyeste tillatte innhold (ML) i like store trinn. Analyser prøvene. Etter identifikasjon skal signalet, dersom dette er mulig, eller den nye beregnede konsentrasjonen plottes i forhold til den tilsatte konsentrasjonen. Beslutningsgrensen (α = 5 %) er lik den tilsvarende konsentrasjonen ved grenseverdien for restmengder eller høyeste tillatte innhold pluss 1,64 ganger standardavviket for den interne reproduserbarheten ved den tillatte grenseverdien.
- Metode 2: \(\begin{align}CC\alpha = \text{øvre grenseverdi for restmengder (eller høyeste tillatte innhold)} + \\k(\text{ensidig}, 95 \%) \cdot \text{(kombinert) standard måleusikkerhet ved} \\\text{grenseverdien for restmengder eller høyeste tillatte innhold.}\end{align}\)
For godkjente stoffer, kan det avhengig av valideringsforsøket (og dets respektive frihetsgrader), være rimelig å anvende t-fordelingen, eller en k-faktor på 1,64 dersom normalfordeling (gaussisk fordeling) (ensidig, n=∞) legges til grunn.Den interne reproduserbarheten og riktigheten er egnet til å definere (kombinert) standard måleusikkerhet, dersom den bestemmes under hensyn til alle relevante faktorer som påvirker målingen.For farmakologisk virksomme stoffer der det er fastsatt en øvre grenseverdi for restmengder for summen av ulike stoffer, skal CCα av stoffet med den høyeste konsentrasjonen i prøven brukes som CCα til å vurdere summen av stoffene i den målte prøven. - For godkjente stoffer i matrise-/artskombinasjoner som det ikke er fastsatt øvre grenseverdier for restmengder for, skal det ikke forekomme restmengder med mindre det er foretatt en godkjent behandling i samsvar med artikkel 11 i direktiv 2001/82/EF. For godkjente stoffer som det ikke er fastsatt noen øvre grenseverdi for restmengder for, skal kaskade-grenseverdien fastsatt i henhold til Kommisjonens gjennomføringsforordning (EU) 2018/470 brukes til å beregne CCα. Metode 1 eller 2 i avsnittet over skal anvendes, men «grenseverdi for restmengder» (MRL) viser til «0,5 ganger kaskade-grenseverdien, der målet er 0,1 ganger kaskade-grenseverdien der det er praktisk mulig».
CCβ skal bestemmes for screeningmetoder. CCβ skal fastsettes som definert under «Ytelseskriterier og andre krav til analysemetoder» som fastsatt i kapittel 1 i dette vedlegget, og i samsvar med kravene i tabell 5. Det er imidlertid ikke nødvendig å anvende alle kravene til identifikasjon (jf. 1.2.3, 1.2.4 og 1.2.5) på screeningmetoder.- For farmakologisk virksomme stoffer som ikke er godkjente eller som er forbudt, skal det sikres en β-feil på høyst 5 %. CCβ skal beregnes på følgende måte:
- Metode 1: Ved framgangsmåten med kalibreringskurve i samsvar med ISO 11843-1:1997 (hvor den kalles «minste påviselige verdi av nettotilstandsvariabelen»). I så fall skal det brukes representativt blindmateriale med tilsetning til og lavere enn referanseverdien for tiltak, eller dersom ingen slik referanseverdi er fastsatt, omkring målkonsentrasjonen for screening (STC) i like store trinn. Analyser prøvene. Signalet plottes mot den tilsatte konsentrasjonen. Påvisningsevnen er lik den tilsvarende konsentrasjonen ved målkonsentrasjonen for screening pluss 1,64 ganger standardavviket for den interne reproduserbarheten for gjennomsnittet av det målte innholdet ved målkonsentrasjonen for screening. Ekstrapolering langt lavere enn laveste tilsetningsnivå (< 50 % av laveste tilsetningsnivå) skal bekreftes av forsøksdata i valideringsfasen.
►M2 - Metode 2: Undersøkelse av blindmateriale med tilsetning på konsentrasjonsnivået til den opprinnelig valgte målkonsentrasjonen for screening. På dette konsentrasjonsnivået skal 20 blindmaterialer med tilsetning analyseres for å gi et pålitelig grunnlag for bestemmelsen. Dersom ≤ 5 % falskt negative resultater gjenstår på dette konsentrasjonsnivået, er nivået likt med metodens påvisningsevne. Dersom det oppnås > 5 % falskt negative resultater, skal den valgte målkonsentrasjonen for screening økes og undersøkelsen gjentas for å kontrollere at kravet om ≤ 5 % falskt negative resultater er oppfylt. ◄M2
- Metode 3: \(CC\beta = STC + k(\text{ensidig}, 95\%)\cdot\text{(kombinert) standard måleusikkerhet ved eller over STC}\).For farmakologisk virksomme stoffer som ikke er godkjente eller som er forbudt, kan det avhengig av valideringsforsøket (og dets respektive frihetsgrader), være rimelig å anvende t-fordelingen, eller en k-faktor på 1,64 dersom normalfordeling (gaussisk fordeling) (ensidig, n=∞) legges til grunn.Den interne reproduserbarheten og riktigheten er egnet til å definere (kombinert) standard måleusikkerhet, dersom den bestemmes under hensyn til alle relevante faktorer som påvirker målingen.
- For godkjente stoffer skal det sikres en β-feil på høyst 5 %. CCβ skal beregnes på følgende måte:
- Metode 1: ved framgangsmåten med kalibreringskurve i samsvar med ISO 111843-1:1997 (hvor den kalles «minste påviselige verdi av nettotilstandsvariabelen»). I så fall skal det brukes representativt blindmateriale med tilsetning til og under den tillatte grensen, i like store trinn med utgangspunkt i målkonsentrasjonen for screening. Analyser prøvene og identifiser analytten(e). Beregn standardavviket for gjennomsnittet av det målte innholdet ved målkonsentrasjonen for screening.Påvisningsevnen er lik den tilsvarende konsentrasjonen ved målkonsentrasjonen for screening pluss 1,64 ganger standardavviket for den interne reproduserbarheten for gjennomsnittet av det målte innholdet ved målkonsentrasjonen for screening.
- Metode 2: Ved undersøkelse av blindmateriale med tilsetning til konsentrasjoner under den tillatte grensen. For hvert konsentrasjonsnivå skal 20 blindmaterialer med tilsetning analyseres for å gi et pålitelig grunnlag for bestemmelsen. I så fall er metodens påvisningsevne lik konsentrasjonsnivået der bare ≤ 5 % falske negative resultater gjenstår.
- Metode 3: \(CC\beta = STC + k(\text{ensidig}, 95\%)\cdot\text{(kombinert) standard måleusikkerhet ved eller over STC}\).For godkjente stoffer, kan det avhengig av valideringsforsøket (og dets respektive frihetsgrader), være rimelig å anvende t-fordelingen, eller en k-faktor på 1,64 dersom normalfordeling (gaussisk fordeling) (ensidig, n=∞) legges til grunn (enten ved kaskade-bruk eller vanlig bruk av øvre grenseverdi for restmengder)Den interne reproduserbarheten og riktigheten er egnet til å definere (kombinert) standard måleusikkerhet, dersom den bestemmes under hensyn til alle relevante faktorer som påvirker målingen.
►M2 ◄M2
Når kalibreringskurver brukes til mengdebestemmelse skal- minst fem nivåer i fortrinnsvis like store trinn (herunder null) brukes for å lage kurven,
- kurvens arbeidsområde beskrives,
- kurvens matematiske formel og dataenes grad av samsvar med kurven (bestemmelseskoeffisient R2) beskrives,
- akseptable områder for kurvens parametrer beskrives.
For kalibreringskurver basert på en standardløsning, matrisetilpassede standarder eller matrisetilsatte standarder, skal det angis akseptable områder for kalibreringskurvens parametrer som kan variere fra serie til serie.
Det er ikke nødvendig å bestemme den absolutte gjenfinningen ved metoden dersom en intern standard og/eller en matrisetilsatt kalibrering er tilgjengelig. I alle andre tilfeller skal den absolutte gjenfinningen ved metoden bestemmes. ◄M2
Når kravene til riktighet i tabell 1 er oppfylt, kan det brukes en fast korreksjonsfaktor. I motsatt fall skal gjenfinningsfaktoren for det bestemte partiet brukes. Alternativt skal framgangsmåten med standardtilsetning() eller en intern standard brukes i stedet for å bruke en korreksjonsfaktor for gjenfinning.
Den absolutte gjenfinningen skal beregnes for minst seks representative partier av matrise.
En delmengde av blankmatrise skal tilsettes analytten før ekstraksjon, og en annen delmengde av blankmatrise skal tilsettes analytten etter tilberedning av prøven ved et relevant konsentrasjonsnivå, og konsentrasjonen av analytten bestemmes.
Gjenfinningen beregnes som følger:
Gjenfinning (analytt) = (signalflate matrisetilsatt standard)/(signalflate matrisetilpasset standard) × 100
Den relative matrisevirkningen skal bestemmes i alle tilfeller. Dette kan enten gjøres som del av valideringen, eller ved separate eksperimenter. Beregningen av relativ matrisevirkning skal foretas for minst 20 forskjellige blindpartier (matrise/art) i samsvar med metodens bruksområde, f.eks. forskjellige arter som skal omfattes.
Etter ekstraksjon bør blindmatrisen tilsettes analytten ved referanseverdien for tiltak, øvre grenseverdi for restmengder eller høyeste tillatte innhold, og analyseres sammen med en ren løsning av analytten.
Den relative matrisevirkningen eller matrisefaktoren (MF) beregnes på følgende måte: $$MF \text{(standard)}=\frac{\text{peak area of MMS standard}}{\text{peak area of solution standard}}$$
$$MF \text{(IS)}=\frac{\text{peak area of MMS IS}}{\text{peak area of solution IS}}$$
$$MF \text{(standard normalisert for IS)}=\frac{\text{MF (standard)}}{\text{MF (IS)}}$$
IS: intern standard
MMS: matrisetilpasset standard
Variasjonskoeffisienten skal ikke være større enn verdiene oppført i tabell 2 i dette vedlegget for MF (standard normalisert for IS). ◄M2.